圖像：冷凍FIB薄片——SEM和共聚焦熒光圖像的疊加。酵母細胞的靶結構（核孔蛋白Nup159-Atg8-split，紅色），用箭頭標記。比例尺：5µm[1].
本文介紹了如何利用冷凍光學顯微鏡，尤其是冷凍共焦顯微鏡來提高冷凍工作流程的可靠性。評估了EM網格和樣品的質量，并分析了目標結構的分布。本文展示了如何將冷凍共焦3D數據投射到SEM圖像上，將感興趣結構可靠地保留在FIB切割的薄片內，以便在冷凍TEM中進行進一步研究。
使用冷凍共聚焦顯微鏡定位核孔復合體
核孔復合體（NPC）是連接真核細胞核外膜和內膜的大的蛋白質組合體。NPC由幾百個核孔蛋白（NUP）組合而成，這些核孔蛋白形成一個中心通道，使分子能夠選擇性地進行核質運輸：RNA和核糖體蛋白質從細胞核運輸，而在細胞質中翻譯的核蛋白質、信號分子、脂質等則穿梭到細胞核中。
為了更好地理解NPC的結構-功能關系以及它們的生物發生和轉換的調節，以最高的分辨率在細胞內部環境下研究它們的結構至關重要。圖1顯示了核膜冷凍電子斷層照片的組分分割圖[2]。斷層照片顯示，蛋白酶體與NPC結合，“在細胞核和細胞質之間的通道上建立了蛋白質降解樞紐"（Albert，S.等人，PNAS，2017年12月）。這清楚地顯示了冷凍電子斷層掃描（cryo ET）提供有關細胞結構和分子社會學的見解的方式。但是，如何用冷凍ET選擇性地檢查發生頻率低的罕見特定細胞事件，例如經歷自噬的NPC？
圖1：冷凍電子斷層掃描的部分區域，顯示出細胞核周圍的原生細胞環境。蛋白酶體在兩個不同位置與核孔復合物（紫色）相連（橙色：膜栓系蛋白酶體，黃色：籃狀栓系蛋白酶體，藍色：游離蛋白酶體）。圖中還顯示了核膜（灰色）、核糖體（黑色/白色）和線粒體（紅色，帶有一排排黃色ATP合成酶）。數據由德國馬丁雷德（Martinsried）生化研究所分子結構生物學部門B. Engel博士提供。原出版物：Albert S, Schaffer M, Beck F, Mosalaganti S, Asano S, Thomas HF, Plitzko JM, Beck M, Baumeister W, Engel BD.“蛋白酶體連接到核孔復合體的兩個不同位點"[2]。
冷凍電子斷層掃描
冷凍ET是一種專用的透射電子顯微鏡技術，該技術采集一系列傾斜圖像，并重建觀察區域的三維體積（圖2）。隨著EM硬件和軟件的最新進展，可以實現亞納米級的分辨率。為了使樣品盡可能接近原生狀態，應將其快速冷凍，以避免破壞性的冰晶形成。產生這種無定形冰的過程稱為玻璃化。
圖2：冷凍電子斷層掃描技術示意圖。使用電子束（TEM）對樣本進行觀察，同時傾斜樣本，從不同觀察角度創建一系列圖像。3D立體容積得到重建，同時可對蛋白質的分布進行可視化觀察與分析。
冷凍FIB研磨
只有厚度低于300nm的標本才能通過冷凍電子斷層掃描直接評估。較厚的樣品，例如用于NPC分析的酵母細胞核，必須通過銑削過程進行打薄。專用雙光束顯微鏡包括掃描電子顯微鏡和聚焦鎵離子束（冷凍 FIB-SEM），用于燒蝕不需要的材料（圖3）。
圖3：聚焦離子束銑削技術示意圖。使用掃描電子束觀察樣本，同時對樣本專門使用了聚焦離子束（FIB），以去除薄冰片（薄層）上方及下方的物質。
在銑削過程中，去除感興趣區域上方和下方的材料，以產生200–300nm厚度的薄片。通過FIB研磨，之前無法檢測的厚細胞標本部分現在可以用于冷凍ET。
低溫光學顯微鏡
為了獲得特定細胞部位（如正在經歷自噬的NPC）的斷層照片，必須在FIB研磨和冷凍ET期間確定感興趣的結構。由于在銑削之前或銑削過程中，大多數結構在SEM中無法清晰識別，因此需要一種在冷凍條件下可視化和定位感興趣分子的方法。
為了解決該問題，要使用冷凍熒光顯微鏡，例如使用THUNDER Imager EM cryo CLEM。使用基因編碼的熒光標記，可以可視化細胞中的特定靶點，并識別和標記感興趣的結構。接著，可以在后續的EM步驟中檢索圖像和xy坐標（圖4）。
圖4：靶區劃定與檢索。冷凍光學顯微鏡和FIB-SEM中的熒光酵母細胞。左圖：酵母熒光圖片，其中顯示了紅色的核仁和綠色的細胞壁。核仁由十字線標記。右圖：在FIB-SEM中檢索相同的位置，以創建包含感興趣細胞核的薄片。此處還顯示了初始銑削階段。薄層上下研磨窗口（黑色區域）可見。比例尺：10µm。圖片由P.Erdmann博士提供；酵母種株由F.Wilfling創建。馬克斯·普朗克生物化學研究所，德國馬丁斯里德。
當然，顯微鏡硬件必須始終保持樣品玻璃化。現代寬場顯微鏡系統使用非常靈敏的攝像頭，甚至可以檢測微弱表達的蛋白質。此外，通過應用最新的實時去除非焦面信號技術技術，可以解決寬場系統固有的難題，如離焦模糊。
然而，僅檢索感興趣結構的xy坐標是不夠的，z坐標也是必要的，以盡可能地使-靶結構包含在產生的FIB薄片中。然而，在寬場顯微鏡中，沿光軸的分辨率是有限的。
為了提高z分辨率，照理說下一步該選擇共聚焦。中間聚焦平面上的針孔會阻擋離焦光線，從而提高對比度和分辨率，尤其是沿z軸的對比度和分辨率（有關共焦原理的更多信息）。
