全場景顯微成像分析平臺MICA集3D采集和AI定量于一體。
3D組織成像廣泛應用于生命科學領域。研究人員利用它來揭示組織組成和完整性的詳細信息，或從實驗操作中得出結論，或比較健康與不健康的樣本。本文介紹了MICA如何幫助研究人員進行3D組織成像。
3D組織成像
模式生物或患者的組織切片可用于分析從組織到細胞的各種形態，進而發現健康和非健康樣本以及對照樣品和實驗樣品之間的差異。例如，是否存在特定細胞或它們的形態（即形狀、體積、長度、面積）都是有意義的參數。
熒光顯微鏡有助于識別特定標記的細胞或細胞組分。因此，要么用轉熒光標記基因生物，要么用免疫熒光染色。此外，某些基因和轉錄也可以通過熒光原位雜交 (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH) 進行可視化。
3D組織成像的一個示例是，對腦部神經元進行成像，以確定它們的長度、體積或與其它細胞的連接。例如，可以對患有局部腦缺血的模式生物制作腦部切片，以了解形態差異和細胞數量。
首要的挑戰之一是使用顯微鏡初步觀察樣本。需要將樣本置于載物臺上并不斷調整三維位置以確保對樣本進行正確成像。你從目鏡或屏幕上看到的只是樣本極小的一部分。因此，要將樣本保持在正確的焦距內并找到正確位置，以便找到感興趣的區域，是一個非常麻煩的過程。MICA的樣本查找功能通過將樣本聚焦并生成每個相關區域的低倍率預覽圖來自動化這個過程，這個功能可以用于整個成像過程的定位。
下一個挑戰是設置成像參數，因此可以在看到感興趣的信號下，避免樣本遭受不必要的光漂白。這一步驟通常要同時選擇激發和接受檢測的技術參數，因為每一項參數都會對樣本和獲得的結果產生不同的影響。使用MICA，您只需輕輕點擊一下“Live"，便可自動完成可視化熒光所需的所有參數設置?？呻S時通過點擊“OneTouch"執行這一自動化設置來優化當前視圖的參數。更改顯微鏡的特定技術參數前，實驗人員通常需要了解更改參數將產生的影響，但在MICA中，設置是輸出驅動型的，也就是說，可定義所需的輸出，然后自動完成對應的調整。
一般而言，第一步是確定要成像的正確位置。實驗人員需要使用目鏡了解樣本的整體概況，并記住不同的位置。數字顯微鏡可以生成樣本的概覽，這可以提供一些幫助，但實驗人員仍然需要指出圖像中要進一步成像的位置。MICA的Navigator工具可簡化這一過程。用戶可以生成低倍或高倍的預覽，輕松定位感興趣的區域，并可以使用工具直接在圖像上標記出感興趣的樣本區域。這樣后續高分辨率圖片就可以保存下來。
高放大倍數物鏡通常需要使用浸沒式介質，最常見的是水和油。水為水溶液中的成像樣品匹配了最佳的光學指數，而油為包埋的成像樣品匹配了最佳的光學指數。水浸物鏡也可用于固定式樣本，但會稍微影響成像質量。MICA可同時滿足兩種需求。水鏡還具有全自動化操作的額外優勢，水的浸入可以自動建立并維持。為進一步提高光學質量，一些物鏡會通過校正環來補償樣本板的厚度。校正環可手動、也可自動操作。MICA配置了自動校正環功能，可實現自動優化。
相對厚度是組織切片成像的另一大挑戰。厚切片會形成較多的散射光，干擾所需信號。THUNDER可減少背景模糊，為組織成像提供了一種寶貴的計算成像方法。 MICA集THUNDER于一體，可在合理的時間范圍內確定感興趣的區域。
除了類似于THUNDER的計算清除方法，共聚焦激光掃描顯微術(CLSM)等光學部分也是3D組織玻片成像的一種方法。這種方法中，可獲得性和可用性方面也是挑戰。
除了技術設置比較復雜，共聚焦顯微鏡所需的培訓時間一般也更長。MICA集共聚焦和寬場成像于一體，減少了成像參數設置，縮短了所需的培訓時間，同時也降低了操作顯微鏡的技能要求。
另外，共聚焦和寬場成像模式的圖像設置有相同的外觀和使用感受，因此，用戶無需學習兩種系統的操作方法。而且，用戶可隨意在寬場和共聚焦兩種模式間切換而無需在兩種成像系統間轉移樣本。
科學實驗的一個關鍵方面是，改變盡可能少的變量，以確定對樣本和結果的任何影響。除了保證樣本處理相同外，另一個方面是針對激發和接收檢測成像參數相同。MICA默認在不同項目中保持成像參數不變，用戶僅基于自己的需求進行調整。可根據參考圖像輕松恢復成像參數。
三個厚度為250µm的小鼠腦部切片包含下述熒光標記物：
細胞核（DAPI，品紅色）
神經元（細胞質GFP，青色）
星形膠質細胞（GFAP-DsRed，紅色）
將切片固定于載玻片支架中（圖1）并置于載物臺上進行成像。
圖1：用于玻片成像的MICA玻片夾，例如組織切片。
在樣本定義中輸入蓋玻片類型和染料等基本信息。利用這一信息，Sample Finder可以識別蓋玻片并自動生成低倍的預覽。對整個蓋玻片的預覽可以用來識別三個組織切片，然后用Navigator工具進行標記。隨后無需手動調整成像參數，便可以在20倍寬場模式下對標記區域生成掃描拼接圖像。在這個放大倍數和分辨率下，就能在組織切片上識別出感興趣的區域，然后用共聚焦顯微鏡成像。此時，MICA會在相關區域切換為共聚焦模式，記錄高清晰圖像，包括三維立體圖像。定義三維立體圖像時，可以手動或單擊鼠標自動設置限制。z Range Finder工具自動確定3D圖像掃描開始和結束部分。
成像后，可借助MICA Learn & Results工具測量樹突棘。為此，使用pixel classifier在疊層投影下識別棘突。pixel classifier簡單易用且功能強大，用戶只需使用類似于繪畫工具的繪圖工具標記對象的示例，在這種情況下為棘突。通過訓練模型，更好地再現輸入，然后提供圖像中其他對象的預覽。經過訓練后，就可使用模型分析圖像。
找到載玻片預覽上單個腦部切片，然后使用Magic Wand工具進行標記以進行掃描拼接。Magic Wand自動識別組織切片的邊界并相應地定義所需的拼接。
圖2：MICA在實驗開始時進行完整的玻片預覽（寬場），便于更輕松地定位。借助該信息的信息，可找到大圖掃描拼接的感興趣區域?？墒褂肕agic Wand工具自動化檢測感興趣區域。
MICA可同時采集最多四個熒光團，因此相比基于濾光塊的序列成像的顯微系統，可有效節約用戶的時間。在單次掃描拼接中，可找到感興趣區域，并在共聚焦模式下以更高的放大倍數觀察更多的細節。
二維圖像需要借助三維數據以獲得更詳細的信息。為此，z界面中定義了三維立體模式。
在CLSM下進行立體采集后（120µm厚），可在三維觀察器中可視化數據，獲得腦部樣本的更多空間信息。
圖3：三維重構CLSM。通過三維采集進一步研究組織切片。利用獲得的三維信息，用戶可以更好地了解樣本的空間狀況，例如了解細胞間的連接。
對于定量來說，可根據三維采集信息生成最大投影來測量樣本樹突棘的平均面積。pixel classifier識別棘突，分析工具則確定面積。得到的數值可繪制成圖，以可視化數據和相關性。圖4顯示了樹突棘面積的直方圖。這些結果也可通過箱線圖的形式顯示，來比較不同的樹突棘群落（圖4）。
圖4：分析。MICA不僅采集圖像，還可對它們進行分析。
為此，可使用基于人工智能技術的pixel classifier來識別相關的圖像細節。隨后，識別出的對象可以被量化并顯示在圖形中。在本示例中，樹突棘的平均面積在最大投影上測量。
MICA是用于三維組織成像的有效工具：使用pixel classifier功能，用戶可以快速了解樣本的整體質量，確定進一步的操作。隨后，Navigator視圖可對組織切片進行更深入的觀察。Magic Wand等工具用于快速定義感興趣的區域，加上4個通道的同時成像，可加快大圖掃描拼接的速度。使用新的z界面使三維采集更加簡化，pixel classifier能輔助后續分析。
簡而言之，MICA集寬場成像和共聚焦成像于一個系統中。它可以幫助用戶在一個系統中完成從圖像預覽到三維細節成像再到分析的整個工作流程。
參考資料：
Efficient Long-term Time-lapse Microscopy, Science Lab (2022) Leica Microsystems.
